INVESTIGAÇÃO ESTRUTURAL E CATALÍTICA DA XAC1330

UMA POSSÍVEL ADENILATO CICLASE INÉDITA EM XANTHOMONAS CITRI

Resumo

Este trabalho apresenta um estudo experimental voltado à investigação estrutural e funcional da proteína hipotética XAC1330 de Xanthomonas citri, agente etiológico do cancro cítrico, doença de relevância fitossanitária e econômica global. A partir de análises in silico, incluindo alinhamento e superposição estrutural predita por Alphafold2, identificou-se a presença do motivo CYTH em XAC1330, domínio associado a proteínas que atuam na ligação e processamento de substratos trifosforilados dependentes de íons metálicos (IYER; ARAVIND, 2002). A similaridade estrutural com a adenilato ciclase YpACIV de Yersinia pestis (SMITH et al., 2006) sustenta a hipótese de que XAC1330 atue como adenilato ciclase (AC), catalisando a conversão de ATP em monofosfato cíclico de adenosina (AMPc), segundo mensageiro associado à regulação de processos celulares e virulência bacteriana. O objetivo central é caracterizar XAC1330 quanto à estrutura tridimensional e potencial atividade enzimática, por meio de expressão heteróloga, purificação, cristalografia de raios X e ensaios de atividade. O gene foi amplificado por PCR, inserido no vetor pET28a via Gibson Assembly e expresso heterologamente em Escherichia coli BL21(DE3), seguido de indução e purificação por cromatografia de afinidade. A remoção da tag de 6x histidina será realizada com protease trombina, a técnica de dicroísmo circular será empregada para avaliar estrutura secundária e estabilidade conformacional em diferentes condições. Ensaios espectrofotométricos, adaptados de Davi et al. (2022), estão sendo realizados a fim de quantificar a formação de AMPc, permitindo inferir a atividade. A determinação da estrutura tridimensional será conduzida por cristalização e análise de difração de raios X em alta resolução, permitindo identificar detalhes moleculares relevantes para sua atuação. Complementarmente, será gerada uma linhagem de X. citri com deleção do gene XAC1330, permitindo avaliar o impacto de sua ausência no fenótipo bacteriano. Adicionalmente, será estudada a expressão nativa da proteína em X. citri, correlacionando a produção com características fisiológicas e potencial papel na patogenicidade. Espera-se que este estudo forneça evidências experimentais inéditas sobre a presença de adenilato ciclases em X. citri, até então não identificadas, e contribua para o entendimento dos mecanismos moleculares associados à sinalização por cAMP em fitopatógenos, ampliando o conhecimento do proteoma bacteriano e oferecendo subsídios para o desenvolvimento de estratégias de controle do cancro cítrico.